nextflow_rnaseq

Pipeline RNA-seq reproducible en Nextflow DSL2 para el dataset GSE52778 (8 muestras paired-end). Procesa desde el control de calidad inicial hasta el análisis exploratorio en R, con contenedores Docker/Singularity.

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1. Requisitos previos

Datos FASTQ

sudo apt install sra-toolkit pigz
chmod +x scripts/download_data.sh
./scripts/download_data.sh

Genoma de referencia

chmod +x scripts/prepare_genome.sh
./scripts/prepare_genome.sh

Estructura esperada tras la descarga:

data/
├── SRR*/
│   ├── SRR*_1.fastq.gz
│   └── SRR*_2.fastq.gz
└── genome/
    ├── Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa
    └── Homo_sapiens.GRCh38.111.gtf

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2. Ejecución del pipeline

Local (Docker)

# Ejecución completa
nextflow run scripts/main.nf -profile docker

# Reanudar una ejecución interrumpida
nextflow run scripts/main.nf -profile docker -resume

HPC Picasso (Singularity + Slurm)

sbatch scripts/script.sh

Para reanudar una ejecución interrumpida en Picasso:

nextflow run scripts/main.nf -profile picasso -resume

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3. Pasos del pipeline

#	Proceso	Módulo	Descripción
1	FASTQC (raw)	01_fastqc.nf	Control de calidad de lecturas crudas
2	Trimmomatic	02_trimmomatic.nf	Eliminación de adaptadores y bases de baja calidad
3	FASTQC (trim)	01_fastqc.nf	Control de calidad post-trimming
4	STAR_INDEX	03_star_index.nf	Generación del índice STAR (una sola vez)
5	STAR_ALIGN	04_star_align.nf	Alineamiento al genoma humano (por muestra)
6	SAMtools	05_samtools.nf	Ordenación, indexado, flagstat e idxstats
7	Picard MarkDuplicates	06_picard_markdup.nf	Marcado de duplicados sin eliminarlos
8	featureCounts	07_featurecounts.nf	Cuantificación por gen (todos los BAMs juntos)
9	MultiQC	08_multiqc.nf	Informe de QC agregado
10	R exploratorio	09_rnaseq_r.nf	Boxplot + PCA con edgeR/ggplot2

3.1. FASTQC

Analiza la calidad de las lecturas FASTQ de cada muestra en paralelo. Los .zip y .html se integran en el informe MultiQC final.

• Módulo: scripts/modules/01_fastqc.nf
• Imagen: quay.io/biocontainers/fastqc:0.12.1--hdfd78af_0

3.2. Trimmomatic

Elimina adaptadores Illumina y bases de baja calidad (paired-end). Los logs se integran en el informe MultiQC final.

• Módulo: scripts/modules/02_trimmomatic.nf
• Imagen: quay.io/biocontainers/trimmomatic:0.39--hdfd78af_2

3.3. STAR (índice + alineamiento)

Dos procesos separados:

• STAR_INDEX: genera el índice una sola vez a partir del FASTA + GTF.

• STAR_ALIGN: alinea cada muestra en paralelo usando el índice generado.

• Módulos: scripts/modules/03_star_index.nf, scripts/modules/04_star_align.nf

• Imagen: quay.io/biocontainers/star:2.7.11b--h5ca1c30_8

3.4. SAMtools

Ordena el BAM por coordenadas, genera el índice .bai, y calcula métricas de alineamiento:

• sort: ordenación por coordenadas genómicas
• index: creación del .bai
• flagstat: resumen de reads mapeados, paired, etc.
• idxstats: estadísticas por cromosoma

Las salidas .flagstat.txt e .idxstats.txt van a MultiQC. El BAM ordenado + índice pasan a Picard MarkDuplicates.

• Módulo: scripts/modules/05_samtools.nf
• Imagen: quay.io/biocontainers/samtools:1.19.2--h50ea8bc_1

3.5. Picard MarkDuplicates

Marca duplicados ópticos y de PCR sin eliminarlos (REMOVE_DUPLICATES=false). El BAM resultante mantiene todas las reads originales con la etiqueta duplicate en el FLAG.

• Entrada: BAM ordenado por coordenadas + índice (de SAMtools)

• Salida: BAM con duplicados marcados + índice → pasa a featureCounts

• Métricas: tabla .markdup_metrics.txt → pasa a MultiQC

• Módulo: scripts/modules/06_picard_markdup.nf

• Imagen: quay.io/biocontainers/picard:3.1.1--hdfd78af_0

• Memoria JVM: 80% de la RAM asignada al proceso (-Xmx)

• Parámetros clave: --ASSUME_SORT_ORDER coordinate, --VALIDATION_STRINGENCY LENIENT

3.6. featureCounts

Cuantifica reads por gen usando todos los BAMs con duplicados marcados como entrada conjunta. Produce una matriz de cuentas (genes en filas, muestras en columnas) y un resumen de asignación.

• Entrada: todos los BAMs de Picard + GTF de anotación

• Salida: featurecounts.txt (matriz) + featurecounts.txt.summary → pasa a MultiQC

• Módulo: scripts/modules/07_featurecounts.nf

• Imagen: quay.io/biocontainers/subread:2.1.1--h577a1d6_0

3.7. MultiQC

Agrega todos los informes de calidad en un único HTML interactivo:

• FastQC (raw + trim)

• Trimmomatic logs

• STAR Log.final.out

• SAMtools flagstat

• featureCounts summary

• Módulo: scripts/modules/08_multiqc.nf

• Imagen: quay.io/biocontainers/multiqc:1.35--pyhdfd78af_1

3.8. R exploratorio

Análisis estadístico con edgeR y ggplot2:

• Boxplot de distribución de expresión antes y después de normalizar (TMM)

• PCA no supervisado por condición (Dexamethasone vs Untreated)

• Módulo: scripts/modules/09_rnaseq_r.nf

• Script R: scripts/bin/rnaseq_exploratory.R

• Imagen: bioconductor/bioconductor_docker:RELEASE_3_18

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4. Ejecución en Picasso (HPC)

El clúster Picasso (SCBI-UMA) usa Singularity/Apptainer en lugar de Docker y Slurm como gestor de colas.

4.1 Preparación del entorno

# Cargar módulos necesarios (ver versiones disponibles con: module avail)
module load Apptainer/1.2.5
module load Java/17

# Verificar que nextflow está disponible
nextflow -version

4.2 Sistema de archivos

Ruta	Uso
$HOME	Repo, scripts, resultados finales, caché Singularity (.sif). Persistente.
$FSCRATCH	Directorio work/ de Nextflow. I/O rápido. Se purga tras ~2 meses.

4.3 Lanzar el pipeline

# Desde la raíz del repo:
sbatch scripts/script.sh

El script script.sh solicita recursos mínimos para el controlador de Nextflow (2 CPUs, 8 GB, 48 h). Cada proceso del pipeline (FastQC, Trimmomatic, STAR_INDEX, STAR_ALIGN×8, SAMtools, Picard, featureCounts, MultiQC, R) se envía como un trabajo Slurm independiente gracias al executor configurado en nextflow.config.

4.4 Reanudar una ejecución interrumpida

# Editar script.sh y añadir -resume al comando nextflow, o ejecutar directamente:
nextflow run scripts/main.nf -profile picasso -resume

4.5 Monitorizar

squeue -u $USER          # ver trabajos en cola
scancel <job_id>         # cancelar un trabajo
cat logs/nf_<job_id>.out # logs del controlador Nextflow

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5. Resultados

Los outputs se guardan en results/:

results/
├── fastqc/            → informes de calidad (raw + trim)
├── trimmomatic/       → lecturas limpias y logs de trimming
├── star_alignment/    → BAM alineados, logs STAR, SJ tables
├── samtools/          → BAM ordenados, índices, flagstat, idxstats
├── picard_markdup/    → BAM con duplicados marcados, métricas
├── featurecounts/     → matriz de cuentas + summary
├── multiqc/           → multiqc_report.html
└── R_exploratory/     → boxplot_raw.png, boxplot_normalized.png, pca_plot.png

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6. Entregables

Según la rúbrica de la actividad, el ZIP final debe contener:

Actividad_Modulo8.zip
├── scripts/                    ← main.nf, nextflow.config, modules/, bin/, assets/
├── memoria_analisis.pdf        ← descripción, parámetros, interpretación
└── resultados/
    └── multiqc_report.html     ← informe de calidad agregado

No incluir en el ZIP: data/, work/, results/ (solo copiar el HTML de MultiQC), archivos FASTQ, BAM, índices, ni datos genómicos.

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7. Notas importantes

• Todas las imágenes Docker usan quay.io/biocontainers/... con tag exacto (incluyendo hash de build de Bioconda). Ninguna usa :latest.
• Memoria recomendada local: mínimo 8 GB RAM.
• En Picasso: STAR_INDEX requiere 64 GB RAM, STAR_ALIGN 45 GB RAM.
• Tiempo de ejecución aproximado en local: 1.5 horas para las 8 muestras.
• En Picasso: el tiempo total depende de la cola; STAR_INDEX tarda ~30-60 min.
• El scripts/bin/rnaseq_exploratory.R se ejecuta dentro del contenedor de Bioconductor; instala automáticamente edgeR, ggplot2, dplyr y tidyr en la primera ejecución.